引言
昆虫可以综合多种感官线索在环境中进行导航，以找到合适的食物来源、交配伙伴或产卵地点。要了解昆虫在多变的嗅觉环境中的飞行行为，需要一个三维空间详细分析其飞行行为。本研究将介绍在三维环境中跟踪Anopheles gambiae sensu lato蚊子的飞行，分析在严格控制的气候条件下蚊子对人类释放的体味和二氧化碳的宿主寻找行为。
根据过往研究和观察，雌性嗜人血蚊子对人类宿主气味的远程飞行策略是，蚊子在接触到带有气味的空气后会向上风方向飞行，如果踪迹消失，则会进行横风飞行。在中等距离，蚊子受到人类释放二氧化碳和体味的影响，会使用高对比度的视觉特征，并在存在短距离宿主线索（如体温和湿度）的情况下开始着陆。虽然这些基本特征是所有寻找宿主的蚊子物种所共有的，但在各自感官线索的相对重要性，可能因宿主偏好和日常飞行活动模式等有所不同。
材料与方法
风洞系统
研究所使用的风洞系统如图1所示。从气候室到预备室和飞行区域，空气要经过一个均衡器，其中气流的温度、湿度和速度变化都会得到稳定（图1A）。在预备室内，可以通过引入气味源等方法操纵流向飞行区域的气流。
在上述风洞装置中跟踪蚊子的飞行行为。风洞温度调整为 27.0°C，相对湿度为 70%，风速设定为 0.22 m s-1。
气味刺激
气味刺激由放置在风洞系统预备室中的两个不同装置（玻璃环和金属袜子架）提供（图2A、B）。不同浓度的二氧化碳通过一个等距开孔的玻璃环产生气流。人类体味则采用实验者穿过的袜子：在实验前19-21小时穿上黑色棉袜，将其卷起，然后悬挂在金属钩上。穿过的袜子可提供最多1小时的气味源，之后用洗涤剂清洗后再重复使用。
研究一中的气味刺激是空气或1,200 ppm二氧化碳与人脚气味或相应对照组（即无袜子和干净袜子）的组合。由此产生的处理组合为 “空气/空气"、“二氧化碳/空气"、“空气/干净的袜子"、“空气/使用过的袜子"和“二氧化碳/使用过的袜子"。在研究二中，二氧化碳本身的浓度为环境浓度（400 ppm 至 445 ppm）或高浓度（1,200、2,400、4,800 ppm）。
实验程序
本研究使用的蚊子为Anopheles gambiae sensu lato蚊子。在每次试验中，装有一只雌蚊的释放笼被放置在释放点。蚊子经过2分钟的适应期后，开始录像，并打开释放笼的门。在3分钟内未进入拍摄的飞行区域（图2A，灰色区域）的蚊子将被剔除，不再做进一步分析。记录有反应的蚊子飞行行为，直到它们在上风屏上着陆至少5秒，或连续飞行长达10分钟。每次试验后，目测蚊子的反应（“飞行"、“不飞行"）和着陆地点（“上风屏"、“其他"、“未着陆"）。每只蚊子只测试一次。
视频追踪和飞行轨迹重建
使用诺达思的多视频录制软件(Media Recorder)以60帧/秒的速度从风洞上方用两台红外光敏感GigE摄像机（图2A）记录飞行行为。六个红外阵列提供照明，放置在飞行区域的下风端。在风洞的上风端，有一个LED 阵列，提供低强度的漫射可见白光，用于蚊子的视觉定向。相机以一定角度安装在风洞上方。
诺达思的动物运动轨迹跟踪系统(EthoVision XT)用于将两台摄像机的视频文件转换为二维位置数据。使用诺达思的三维运动轨迹跟踪系统(Track3D)将二维位置数据合并为三维飞行轨迹。以下变量由Track3D计算并用于后续分析：三维位置（x、y、z）、飞行速度和垂直面航向角。
研究结果
研究一——人类宿主
在447只接受测试的蚊子中，有161只在打开笼门后3分钟内做出反应，进入拍摄区域。人类宿主对蚊子的反应数量有显著影响，其中二氧化碳和人类脚味这两个因素以及它们之间的相互作用对观察到的影响有显著作用。与所有其他处理相比，同时暴露于二氧化碳和人脚味时，有更大比例的蚊子（约70%）进入拍摄区域（图3A）。其他处理之间没有明显差异。
当存在人类宿主线索时，蚊子在研究设定的感兴趣体积（VOI）内飞行的比例较大（图3B）。二氧化碳和人脚气味的组合诱发蚊子在VOI内飞行的比例最高。与空气对照组相比，单独的人脚气味会导致在VOI内的飞行显著增加，而空气对照组与清洁袜子对照组之间没有差异。
在分析至少接触过一次VOI的蚊子的平均横风飞行速度时（图3C），发现人脚气味和空气对照的组合与清洁袜子控制之间存在显著差异。与空气对照组相比，接触二氧化碳和人脚气味的蚊子平均飞行速度快1.3倍。
在161只蚊子中，有108只在10分钟的最长记录时间内着陆。不同处理之间没有明显差异（图3D）。然而，蚊子落在目标区域的比例受到二氧化碳和人脚气味因素的显著影响，在二氧化碳和人脚气味的作用下，57%的蚊子落在上风屏上的目标区域，而空气和清洁袜子对照分别为3%和10%。这些差异在不同处理间有显著性差异（图3D、E）。
研究二——二氧化碳
在研究二中，235只蚊子有107只进入了拍摄区域。未观察到二氧化碳浓度的显著影响。未观察到二氧化碳浓度对VOI内飞行比例的影响。VOI内的飞行比例普遍较低，从1200 ppm的0.2%到2400 ppm的2.9%不等。在比较两种处理方法时，没有观察到横风飞行速度的显著差异。两种处理之间没有横风飞行频率增加的趋势。在10分钟的最长记录时间内，101只蚊子中有77只落下。没有观察到蚊子降落的总比例有显著差异，也没有观察到落在目标区域的蚊子比例。
讨论
本文的研究展示了在风洞系统中运用三维轨迹分析蚊子飞行的实验研究。在本研究中，当人类脚味和二氧化碳结合在一起时，蚊子的横风飞行速度更快，在气味流中停留的时间更长，并更成功地锁定气味源。相比之下，雌性Anopheles gambiae sensu lato蚊子在不同浓度的二氧化碳作用下，并没有表现出寻找宿主的行为。这些观察结果支持了之前关于人类宿主相关线索在宿主寻找中过程中作用的研究结果，并证实了二氧化碳不是单独的宿主寻找线索。本文为未来不同环境下研究昆虫三维空间飞行行为提供了方法。
参考文献
Hinze, Annika, et al. “Mosquito host seeking in 3D using a versatile climate-controlled wind tunnel system." Frontiers in Behavioral Neuroscience 15 (2021): 643693.
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